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    干貨丨如何繪制和檢驗校準曲線?

    發布日期: 2022-09-08 作者: 來源: 農業檢測 【字體: 打印本頁

      凡應用校準曲線的分析方法,都是在樣品測得信號值后,從校準曲線上查得其含量(或濃度)。因此,繪制準確的校準曲線,直接影響到樣品分析結果的準確與否。此外,校準曲線也確定了方法的測定范圍。

      校準曲線包括標準曲線和工作曲線,前者用標準溶液系列直接測量,沒有經過預處理過程,這對于樣品往往造成較大誤差;而后者所使用的標準溶液經過了與樣品相同的消解、凈化、測量等全過程。

     

    如何正確繪制校準曲線 

      用一系列被測物標準溶液,按照標準方法規定的步驟,將被測物轉變為有色溶液,制備好的標準系列和空白,在方法選定的波長下,測定吸光度。已被測物濃度為橫坐標,吸光度為縱坐標,繪制校準曲線。

      步驟:

      1、對標準系列,溶液以純溶劑為參比進行測量后,應先作空白校正,然后繪制標準曲線;

      2、標準溶液一般可直接測定,但如試樣的預處理較復雜致使污染或損失不可忽略時,應和試樣同樣處理后再測定;

      3、校準曲線的斜率常隨環境溫度、試劑批號和貯存時間等實驗條件的改變而變動。

      因此,在測定試樣的同時,繪制校準曲線最為理想。否則,應在測定試樣的同時,平行測定零濃度和中等濃度標準溶液各兩份,取均值相減后與原校準曲線上的相應點核對。其相對差值根據方法精密度不得大于5%~10%,否則,應重新繪制校準曲線。

    如何檢驗校準曲線 

      1、線性檢驗

      即檢驗校準曲線的精密度,對于以4~6個濃度單位所獲得的測量信號值繪制的校準曲線,分光光度法一般要求其相關系數|r|≥0.9990,否則應找出原因并加以糾正,重新繪制合格的校準曲線。

      2、截距檢驗

      即檢驗校準曲線的準確度,在線性檢驗合格的基礎上,對其進行線性回歸,得出回歸方程y=a+bx,然后,將所得截距a與0作t檢驗,當取95%置信水平,經檢驗無顯著性差異時,a可做0處理,方程簡化為y=bx,移項得x=y/b。在線性范圍內,可代替查閱校準曲線,直接將樣品測量信號值經空白校正后,計算出試樣濃度。

      當a與0有顯著性差異時,表示校準曲線的回歸方程計算結果準確度不高,應找出原因予以校正后,重新繪制校準曲線并經線性檢驗合格。在計算回歸方程,經截距檢驗合格后投入使用?;貧w方程如不經上述檢驗和處理,就直接投入使用,必將給測定結果引入差值相當于解決a的系統誤差。

      3、斜率檢驗

      即檢驗分析方法的靈敏度,方法靈敏度是隨實驗條件的變化而改變的,在完全相同的分析條件下,僅由于操作中的隨機誤差導致的斜率變化不應超出一定的允許范圍,此范圍因分析方法的精度不同而異,例如,一般而言,分子吸收分光光度法要求其相對差值小于5%,而原子吸收分光光度法則要求其相對差值小于10%等。

    如何正確的控制校準曲線 

      被測物轉變為有色溶液的反應稱為顯色反應或發色反應,顯色反應介質的pH條件、顯色劑用量、顯色反應的時間和溫度、為消除共存物干擾而加入的掩蔽劑、甚至加試劑的順序,都要按照方法步驟的要求執行。有時,標準系列雖然不像實際試樣那樣組成復雜,但仍要求與試樣進行同樣的處理步驟,以便控制校準曲線上的數據點的空白、回收率等因素。

      建立校準曲線時,測量吸光度的參比有兩種選擇:

      第一種方法用純溶劑作參比,兩個比色皿都放溶劑時,“樣品比色皿”的吸光度測定值為比色皿成對性校正值。此后,所有樣品吸光度測定值都須扣除此值,進行校正,然后,以純溶劑為參比,測定空白及標準系列的吸光度,繪制校準曲線。

      第二種方法直接用空白為參比,當兩個比色皿都放空白時,測定比色皿成對性校正值,然后,測定標準系列的吸光度,繪制校準曲線。

      兩種方法得到的兩條校準曲線互相平行,但*種方法可測定空白的水平,后一種方法不能測定空白,理論上校準曲線通過原點。

      若空白為零,兩條校準曲線重合。

      無論用什么作參比,實樣測定時應該使用與建立校準曲線相同的比色皿和同樣的參比。比色皿的成對性校正對于使用已久的比色皿有必要,尤其是測量吸光度很小的樣品時,校正可保證測量值的可靠性和重復性。

    小結 

      使用校準曲線時應注意:校準曲線包括“標準曲線”和“工作曲線”。應用標準溶液制作校準曲線時,如果分析步驟與樣品的分析步驟相比有某些省略時,則制作的校準曲線稱為標準曲線。如果模擬被分析物質的成分,并與樣品完全相同的分析處理,然后,繪制的校準曲線稱為工作曲線。因此,如果基體效應對分析方法至關重要時,應使用含有與實際樣品類似基體的標準溶液系列進行校準曲線繪制。

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